本方案介绍如何将合成的siRNA有义链和反义链复性形成双链siRNA,以及利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对双链siRNA进行分析。
试剂
丙烯酰胺：双丙烯酰胺（19:1,40%,m/V)
过硫酸铵(10%,m/V)
复性缓冲液（10X)
2‘脱保护缓冲液[100mmol/L乙酸，用四甲基乙二胺(TEMED)调整pH至3.8]
DNA分子质量标准
非变性凝胶上样缓冲液(10X)
无核酸酶水
siRNA
10mg/mL溴化乙锭
TBE缓冲液(5X,0.5X)
设备
离心机
加热模块(37°C,60°C,95°C)
微量离心管(1.5mL)
聚丙烯酰胺凝胶电泳仪
分光光度计
真空离心蒸发浓缩器或者替代品
紫外灯
涡旋振荡仪
方法
1.将siRNA溶解于无核酸酶水。使用分光光度计测量siRNA的浓度。将RNA溶液放置冰上以防止RNA降解。
2.进行以下复性步骤，生成20μmol/L的双链siRNA溶液。
有义链siRNA
2nmol
反义链siRNA
2nmol
复性缓冲液(10X)
10μL
无核酸酶水
补足至100μL
3.95°C孵育5mm,37°C孵育2h。将siRNA溶液保存于－20°C或者－80°C。
4.利用以下试剂制备一块浓度为12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶（如Bio-RadMiniPROTEAN，8)
TBE缓冲液(5X）
丙烯酰胺：双丙烯酰胺(19:1，40%,m/V)
去离子水
1mL
1.5mL
补足至5mL
室温下混匀，而后加入
过硫酸铁(10%,m/V)
TEMED
50μL
5μL
5.迅速混匀上述溶液，然后将其倒入制胶仪中使其聚合。
6.将双链siRNA溶解于2μmol/L的1X非变性胶上样缓冲液中。
7.将正义和反义siRNA分别溶解千4μmol/L的lX非变性胶上样缓冲液中。
8.每个样品上样5μL,在0.5XTBE缓冲液中进行电泳，电压5V。电泳需要在低电压条件下进行以避免样品受热变性。
9.电泳结束后，使用溴化乙锭（1:20000溶解于0.5XTBE缓冲液中）在室温下染色5min，在紫外线下观察RNA条带。
配方
复性缓冲液(10X)
试剂
数量（配制100mL)
终浓度(10X)
乙酸钾(2mol/L)
50mL
1mol/L
HEPES-氢氧化钾(KOH)(1mol/L,)
30mL
300mmol/L
乙酸镁(lmol/L)
2mL
20mol/L
水
补足至100mL
室温下储存。
非变性胶上样缓冲液(10X)
试剂
数量（配制100mL)
终浓度(10X)
Ficoll-400
15g
15%(m/V)
XylenecyanolFF
250mg
025%(m/V)
溴酚蓝
250mg
025%(m/V)
水
补足至100mL
分装为1mL,-20℃储存。
