一、假设目标蛋白的信息
名称：XXX蛋白
大小：30kDa
缓冲液：PBS
浓度：0.6mg/mL
体积：6mL（3管分装）
标签:仅6Xhis
纯度：90%以上
二、实验过程
1蛋白表达载体的构建
1.1序列二基因序列密码子优化后合成及构建
Optimizedforyourreference:
CATATGxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxCTCGAG
合成时候带上上下游酶切位点分别是NdeI，XhoI（黄色阴影），并克隆到原核表达载体Pet24a载体。
1.2DNA测序
将经菌落PCR鉴定为阳性克隆测序，测序工作由华大基因完成（见附件）。
2构建正确的Pet24a-序列二表达载体在大肠杆菌中的表达
2.1转化至大肠杆菌BL21(DE3)
常规CaCl2法。
2.2IPTG诱导融合蛋白的表达
2.2.1挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/mlKan的3mlLB培养液的试管中，37℃220rpm振摇过夜；
2.2.2次日按1：100接种于50μg/mlKan的30mlLB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.4(约2h)；
2.2.3取出1ml培养物，12000g室温离心2min，弃上清，用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；
2.2.4向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mmol/l，37℃220rpm振摇4h，诱导序列二蛋白表达；
2.2.5取出1ml培养物，12000g室温离心2min，弃上清，用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀，剩余培养物4℃4000g离心12min，弃上清，沉淀置-20℃冻存。
2.3表达产物分布的确定
2.3.1将表达菌体重悬于400μlNi-IDABinding-Buffer(20mMTris-HCl，5mM咪唑，0.5MNaCl，)；
2.3.2重悬液进行超声波破碎(冰浴中进行)：功率100W，工作4sec，间歇8sec，共10min；
2.3.3超声破碎液4℃12000g离心20min，取10μl上清液加入等量的2×上样缓冲液，沉淀用400μl1×上样缓冲液重悬后取5μl，恒压150V进行12%SDS-PAGE，考马斯亮蓝R250染色显带。
3融合蛋白的纯化
3.1将1L诱导表达的培养菌体沉淀用20mlNi-IDABinding-Buffer重悬后，超声破碎(功率200W，工作4sec，间歇8sec，共20min)，4℃12000g离心20min，取上清；
3.2利用BiologicLP层析系统，上清液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDABinding-Buffer预平衡的Ni-IDA-SepharoseCL-6B亲和层析柱；
3.3用Ni-IDABinding-Buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；
3.4用Ni-IDAWashing-Buffer(20mMTris-HCl，30mM咪唑，0.5MNaCl，)以1ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；
3.5用Ni-IDAElution-Buffer(20mMTris-HCl，250mM咪唑，0.5MNaCl，)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；
3.6进行12%SDS-PAGE分析。
三、实验结果
SDS-PAGE结合考染鉴定纯化的XXX蛋白
1-4泳道分别指XXX蛋白放大表达后的全菌、破碎上清、纯化时20mM咪唑洗脱液以及250mM咪唑洗脱液。
