显微镜之宽场显微镜最甜CP

双十一刚过，肯定有不少小伙伴剁手了吧。双十一不只是电商的购物狂欢节，还是令人心痛的单身日。小编作为单身狗着实羡慕那甜美的爱情。所以我只能化悲愤为力量全身心的投入到工作中去。作为仪器工作者本以为显微镜就是我最好的伙伴，后来发现我还是太年轻了，在这个讲究CP感的时代里，我着实被宽场显微镜里最甜的CP秀了满满一脸。

作为报复的手段，我要把他们的故事讲给大家听，宽场显微镜最甜CP-景深扩展与反卷积，接下来我就好好扒一扒它们的前世今生。

首先有请我们的男主角闪亮登场。景深扩展又称Z-Stacking，在说他的故事前，我们需要明白什么是景深。当镜头对着处于焦面物体拍摄时，被拍摄物体与其前后的景物有一段清晰的范围，这个范围我们将其称为“景深”。为了让大家更好的理解，我在这里给大家举个例子。

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就像图中一样，我们在观察与拍照过程中，有时仅可以看清楚花瓣，有时花瓣根茎叶都可以看清楚，这就是因为景深大小不同所致，大景深看清的物体多如左图，小景深看清的物体少如右图，那为什会产生这样的区别呢？

一个镜头只有一个焦平面。处于焦平面上的物体经过物镜会在目镜或相机芯片上形成一个点，非焦平面上的点会形成一个模糊圆，这个圆术语叫做弥散圆（circleofconfusion），怎么去理解这段话呢？

如图所示，黑色线条为焦平面，焦平面上的点经过物镜，在相机芯片或视网膜上形成一个小圆点，两条绿色的线分别是非焦平面，非焦平面点经过目镜会形成一个圆圈，这个圆圈就是弥散圆（circleofconfusion）。如果我们远离这张图片，那会发生什么呢？我们中间的这个小点就看不到了，上下的两个圆斑会越来越小，一直小到和这个点一样大的时候，我们这时候就认为它不是斑，而是点了。如果弥散圆小到人眼或芯片无法鉴别看起来就是一个点，那这个弥散圆称为容许弥散圆，可产生容许弥散圆的平面之间的距离称为景深。

我们再简单一点，显微镜的景深就是当前镜头，可以看清楚样品的厚度。对于观察者来说，同视野下能看清楚样品的厚度越厚越好，越厚就证明镜头的景深越大。在显微观察中是否可以无限制追求大景深呢？答案是否定的。因为景深与物镜的NA值负相关，而NA值与物镜的分辨率及放大倍数正相关。关系如下图所示：

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如何在高倍镜下获得大景深的图像呢？这就轮到我们的男主出场了—景深扩展。

在宽场显微镜中，增大显微图像景深的通常做法是对样品进行不同厚度位置的扫描，并采集程序列图像，以一定的规则进行融合，通过计算重建一幅大景深图像。

目前显微镜实现景深扩展的基础是什么？

硬件基础：显微镜景深扩展分为手动景深扩展与自动景深扩展。对应的硬件基础分别为手动准焦螺旋（手动Z轴）与电动准焦螺旋（电动Z轴）。

软件基础：Z轴控制与图像处理。

如果想把我们男主角的魅力发挥到极致，电动Z轴必不可少。因为与手动景深扩展相比电动的优势有：1、一致性更高2、步进精度更高3、可重复性更好4、操作更为简便。

从上文的介绍中大家明白了景深扩展优化了显微镜在竖直方向的成像效果，那与他在一起的反卷积的功能也就呼之欲出了：优化宽场显微镜水平方向的成像效果。

接下来有请我们的女主角登场，同样的，在讲她的故事之前，我们要明白宽场显微镜存在分辨率的极限。

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从分辨率的公式中可以看出分辨率与NA值正相关。还记得上文中提到的景深与其负相关吗？所以说从家庭背景的角度上景深扩展与反卷积就开始彼此纠缠了。书归正文，通过分辨率公式我们可以得出分辨率的极限是200nm，为了纪念公式的提出者—德国的光学物理学家恩斯特阿贝，人们把这个极限值称为阿贝极限。人们为了突破分辨率极限诞生了以共聚焦显微镜为代表的超高分辨率显微镜。它们通过改变照明结构来突破宽场显微镜的分辨率极限，以获取更加清晰的观察结果。

今天我们讨论的是宽场显微中的最甜CP，共聚焦显微镜改变了光路结构不在今天的讨论范围内。那除了硬件改变来提高分辨率，可不可以不改变宽场显微镜的光路结构，通过软件来实现分辨率的突破呢？答案是有的，那就是我们的女主角反卷积。

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我们先看上面的图，如图所示理想的镜头成像时，一个对焦平面上的物点会投影为一个像点，但事实上理想的镜头是不存在的，镜头总是存在一些缺陷会导致一个物点会投影为很多点，一个点经过镜头后成的像由点扩散函数PSF(PointSpreadFunction)来描述。是不是听起来有些懵？简单给大家做个比喻，有美女或帅哥站在你的面前，理论上你可以清楚地看到他的容貌，但实际过程中你和美女帅哥之间多了一块毛玻璃，这块毛玻璃就是扩散函数，那能不能把这块毛玻璃打碎呢？可以的，这就需要用我们的女主角反卷积了。

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如图所示，我们会有一个很自然的想法就是，如果我们有实际镜头的成像，另外还知道了镜头的PSF，即我们知道了上式的b和c，是否可以得到更加理想的成像x呢？这个过程称为去卷积Deconvolution。

经过上面的介绍，相信大家就会明白为什么我会把景深扩展与反卷积称为宽场显微镜最甜CP了吧。男主角景深扩展充满活力地在Z轴方向上下翻飞，优化显微镜竖直方向的成像效果。女主角反卷积稳重包容在水平方向突破自我。这里我还要提一点特别重要的，很多小伙伴认为反卷积作为一种算法没有硬件的改变是不是随意搭配任何机型都可以实现。其实不然，每一个公司的每一个型号上的每一颗物镜都只有唯一的反卷积公式。

最后总结一下，想必大家应该明白我为什么去写这篇文章了。在显微观察过程中存在很多不同的功能，我选择跟成像质量最相关的功能拿出来跟大家说一下，就是希望小伙伴们在学习与工作中更好的去使用显微镜。

口说无凭眼见为真嘛，大家可以用自己实验室的显微镜试一下这对CP的魅力，这两个功能虽然在市面上很常见，但是能集二者与一身的显微镜并不多，怎么解决呢？欢迎大家来试用我们的ECHO显微镜吧。