用于携带DNA片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体必须满足以下基本条件：①具有对受体细胞的可转移性，能携带外源其因进入宿主细胞；②能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；③具有由单一限制性内切核酸酶识别位点组成的多克隆位点（mulfiplecloningsite，MCS），可供外源基因的插入；④具有合适的选择性标记，用于含有重组质粒的宿主细胞筛选。
天然质粒往往存在这样或那样的缺陷，不适宜直接用作克隆载体，往往需要进行人工改造。结合上述条件，这些改造也就主要集中在以下几个方面∶
（1）选择合适的复制起始位点。为了使构建的质粒克隆载体能在受体细胞中进行有效复制，且获得足够数量的拷贝数，需要改变复制起始位点，一般选择组装松散型质粒复制起始位点。
（2）加入合适的选择标记基因。为便于重组子筛选，需要在质粒克隆载体上加入合适的标记基因，主要有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）和抗生素抗性基因。前者用于克隆子蓝、白斑筛选；常用的抗生素抗性基因主要有氨苄青霉素抗性其因（ampicillinresistancegene，ampr)、四环素抗性基因（tetracyclineresistancegene，tetr）、氯霉素抗性基因（chloramphenicolresistancegene，cmr）、卡那霉素抗性其因（kanamycinresistancegene，kanr）和新霉素抗性基因（neomycinresistancegene，neor）等。
（3）增加或减少酶切位点。质粒载体利用限制性内切核酸酶识别位点来作为外源DNA片段插入的克隆位点，这种位点必须是单一酶切位点，而且数量越多越便于多种类型末端的DNA插入。可通过删除天然质粒中的部分重复的限制性内切核酸酶识别位点使之成为单一酶切位点，也可通过增加新的单一限制性内切核酸酶位点，在特定的部位（如在筛选标记基因上）组装一个含有多种单一限制性内切核酸酶识别序列的多克隆位点（MCS）。
（4）缩短长度。质粒转化受体细胞的效率同质粒DNA分子大小相关，小分子质量质粒转化效率较高。可通过切去质粒上不必要的片段，提高转化宿主细胞的效率，提高其外源DNA片段的装载量。
经过改进和创新的克隆载体越来越小、容量越来越大、工作效率越来越高及使用越来越方便。
