固定化金属离子亲和层析（IMAC）现在算是蛋白亲和层析中的主要技术了。主要是操作比较简单，纯化比较容易。所以首次接触蛋白纯化实验者，很多是从6His这一连续的组氨酸肽标签开始的。
基本原理
蛋白质中的组氨酸、半胱氨酸和色氨酸侧链能够与过渡金属（Cu2+、Ni2+、Co+、Zn3+等）相互作用，而通过鳌合配基亚氨基乙二酸（IDA），金属离子得以固定，从而使这一氨基酸侧链的特性可以用来纯化蛋白质。经过一系列的学者的研究推进，最终形成6个组氨酸作为融合肽段来纯化蛋白质的经典方法。
基本操作
蛋白质在中性条件下（），吸附到固定化的金属离子上的能力通常不受高离子浓度的影响。实际上，在缓冲液中经常加入0.1-1MNaCl以减少非特异性静电相互作用。
缓冲液中，磷酸盐、Tris、硼酸盐、HEPES和乙酸盐缓冲液都可行。常用的缓冲液浓度为20-100mM，非离子型表面活性剂、尿素、盐酸胍等不影响IMAC对组氨酸的吸附作用。
实际使用过程中，还原剂不推荐加入，因为还原剂可能会造成金属离子的剥落。如果必须使用，则应在较低的浓度，如DTT不宜超过1mM。
实验流程
在此提供一个基于原核表达的实验流程：
大肠杆菌经发酵培养后，通过8000rpm离心5-8min，收集菌体。使用适量的LysisBuffer(此处推荐Qiagen的NPI-10的采用超声波破碎。
破碎后的裂解液经过1200rpm，4℃离心15-20min，取上清（假设目标蛋白没有形成包涵体）。
经过0.45um或者0.2um滤膜过滤，过滤液经过Ni-NTA填料柱吸附。此处操作步骤针对手工操作纯化柱的情况，如果使用AKTA或等效的蛋白纯化系统，则这些步骤太具有参考意义，在此更多考虑初学者来编写这个流程。
使用NPI-10溶液2-5CV体积洗涤层析柱，如果要求不高，就可立即使用含高浓度咪唑的NPI-500洗脱蛋白。但如果要求较高纯度的蛋白，或者后续不再有其他纯化方法进一步提高蛋白纯度，可使用系列梯度浓度的咪唑对层析柱进行洗涤。该操作可将结合不太牢固的非目标蛋白洗脱，而目的蛋白仍能吸附于Ni-NTA上。
对洗脱的含目的蛋白的溶液进行脱盐处理，如没有专门的脱盐层析柱，透析是一个更为易得的脱盐方法。
注：关于LysisBuffer和ElutionBuffer以及透析Buffer，可参考前面文章。
关于His标签的问题
标签序列
六个His最为经典，我们常见的pET载体内的His标签一般也是6个His。当然也有8个（Qiagen的pQE载体）甚至14个His的，也有间隔His的，详见下图。以MP的经验，6His足够了，在His标签的序列和长短耗费精力对初学者没有多少必要。
His-标签在N端还是C端？
组氨酸标签通常加在蛋白质的两端以增加其暴露，避免被折叠藏在蛋白结构域内部。但是，将His标签放于蛋白N端还是C端，尚无明确的结论，两者均有利有弊。通常，无论是放在哪一端都不太会明显影响蛋白表达。以MP个人经验，对于初学者，大多数人只用IMAC来纯化他们的目的蛋白，而克隆自基因甚少进行密码子优化以适应表达宿主，于是就有可能在翻译过程中会有提前终止的“不完全体”蛋白，在这种情况下，为了蛋白的纯度考虑，MP推荐使用C端His，因为，凡是带有His标签的蛋白必然是完整的序列，而N-段His标签就不能保证这一点。
进一步的信息：
现在常见的IMAC所使用的多是Ni固定在交联琼脂糖的球状颗粒上，ThermoFisher也有Co离子的填料出售。GE和Biorad,Qiagen,ThermoFisher都提供IMACResin，这些树脂通常保存在20%乙醇溶液中，且价格不菲，大约均在100元人民币/mL。国产厂家可能会便宜些，常见的有上海博格隆，常州天地人和等。
树脂填料的价格还与颗粒的大小有关，通常颗粒越小，价格越高，分辨率也越好。至于吸附能力，Qiagen家的Ni-NTAAgarose声称为5-10mg/mL，而GE的NiSepharose则有40mg/mL的结合能力。
至于树脂的流速与耐压能力，就不在此详述了。感兴趣的小伙伴可去下载说明书阅读一下。
参考文献：
1.,,2ndEdition,2009.
2.:ALaborartoryManual.
3.AffinityChromatography,:
