荧光定量WesternBlot，绝对不是上样量越多越好。可靠的WesternBlot印迹数据通过加载适当量的样品才能获得。加载过多的蛋白会导致信号饱和或用于检测的荧光基团的自猝灭。
那么，您如何知道要加载多少裂解液呢？首先使用BCA或Bradford等蛋白测定方法测量裂解液样品的浓度。一旦知道样品的浓度，便可以确保每种样品的加载量相同。
于此同时，您仍然需要一种方法来校准凝胶加载量和转印效率的问题。蛋白印迹定量的最佳方法和新共识是将蛋白进行归一化。许多期刊都接受了总蛋白质归一化（TPN），有些期刊（例如《JBC》）甚至要求作者在Western印迹的定量数据时使用TPN或使用验证过的看家蛋白进行归一化。
在下面的实验中，加载了0.2-50µg的HeLa裂解物，以检测靶标蛋白STAT3与内参对照GAPDH和总蛋白膜染色的性能。尽管Total-PVDF膜染色线性最高至50μg裂解物，但这显然不是靶标蛋白STAT3加载的理想上样量，因为信号在12.5μg以上不再线性。上样控制GAPDH的归一化提出了一个严重的问题，因为它在裂解物的浓度低于1µg时呈线性，因此其定量用途非常有限。
一般而言，我们建议不要加入超过20µg的裂解物，因为这通常会导致蛋白定量方面的问题。为了获得最佳的荧光定量Western印迹，不要忘记应用适当的归一化策略并加载适量的蛋白。
AzureImager多功能分子成像系统
☑双激光近红外成像：激发强度大、信噪比高、光泄漏少。
☑RGB可见荧光多功能检测：可进行小鼠成像、转基因植物筛选、模式生物斑马鱼成像、培养皿成像等。
☑同时4通道荧光成像，检测更高效。
☑高灵敏化学发光和彩色Marker成像。
☑彩色蛋白胶和核酸胶成像。
参考文献：
1.
website.:.
2.(50).29692–29694.PMCID:PMC4705984.
