层析技术:生物化学实验常用技术

层析技术是近代生物化学最常用的分离技术之一。它是利用混合物中各组分的理化性质（吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差异，在物质经过两相中，不断地进行交换、分配等过程。任何层系都具有两个相，即固定相和流动相。固定相固定不动，流动相对固定相作单相的相对运动，从而推动样品中各组分通过固定相向前移动。由于混合物中各组分的理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断的吸附－解吸－吸附－解吸作用，造成混合物中各组分距离不等的迁移，从而达到分离的目的。层析技术的分类方法有多种。根据两组分所处的物理状态可分为：气相层析和液相层析。气相层析指的是流动相为气体，固定相可以是液体（气液层析）也可以是固体（气固层析）；液相层析指的是流动相为液体，固定相可以是液体（液液层析）也可以固体（液固层）。根据层析的方式可分为：纸层析、薄层层析和柱层析。纸层析指的是滤纸作固定相进行的层析；薄层层析是将固定相研成粉末，再压成薄膜或薄板，类似于纸层析；柱层析是将固定相装于柱内的层析。根据层析的原理可分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析。下面根据层析的原理，依次介绍这些层析。

一、吸附层析
一、基本原理
任何两个相都可以形成表面，其中一个相的物质或溶解在其中的溶质，在另一相表面上密集的现象，称为吸附。其中，能够将其它物质聚集到自己表面上的物质，称吸附剂；聚集于吸附剂表面的物质称吸附物。当混合物随流动相流经由吸附剂组成的固定相时，由于吸附剂对不同的物质具有不同的吸附力，从而使不同组分的移动速度也不相同，最终达到分离的目的。由于吸附过程可逆的，因此被吸附物在一定条件下可以解析出来。假如混合物中含A、B两种物质，在洗脱过程中，随着流动相流经固定相，它们会连续不断地分别产生解吸－吸附－解吸－吸附的现象。由于洗脱液和吸附剂对A、B的解吸（溶解）与吸附力不同，A和B的移动速度也就不同。溶解度大而吸附力小的物质走在前面；溶解度小而吸附力大的物质走在后面。经过一段时间以后，A、B两种物质就会分开。

二、常用吸附剂的类型及特性
层析用的吸附剂应该满足以下要求：在层析溶剂中不溶解；对洗脱液及被分离物质呈化学惰性；吸附能力强，同时具吸附可逆性；分子扩散速度应尽可能地快。常用吸附剂是多孔结构的。粒子大小、形状以及孔的结构是影响层析的基本因素。下面简要介绍几种常用吸附剂：
1．硅胶硅胶略带酸性，适用于中性和酸性物质的分离，如氨基酸、糖、脂类等，其优点是：化学隋性强、吸附量大、制备容易。
2．氧化铝氧化铝略带碱性，适用于中性及碱性物质的分离，如生物碱、类固醇、维生素、氨基酸等。其优点是：吸附量大、价格低廉、分离效果好。
3．活性炭活性炭大多以木屑为原料。根据其粗细程度可分为三种：粉末活性炭：颗粒极细，呈粉末状，吸附量及吸附力大；颗粒活性炭：颗粒较大，比表面积及吸附力都比粉末活性炭小；锦纶－活性炭：以锦纶为粘合剂，将粉末活性炭制成颗粒，比表面积介于粉末活性炭和颗粒活性炭之间，吸附能力较两者弱。
分配层析
㈠基本原理
分配层析是利用混合物中各组分在两种不同溶剂中的分配系数不同而使物质得到分离的方法。
分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中的溶解达到平衡时，该溶质在两种溶剂中所具浓度之比。不同的物质因其在各种溶剂中的溶解度不同，因而具有不同的分配系数。在一定温度下，分配系数可用下式表示：
Kd=C2/C1
式中，Kd为分配系数；C2是物质在固定相中的浓度；C1是物质在流动相中的浓度。分配系数与温度、溶质及溶剂的性质有关。